Is orgánach seadánacha é Giardia duodenum a chruthaíonn giardiasis, ionfhabhtú intestinal atá coitianta go háirithe i leanaí óga le comharthaí cliniciúla buinneach.Thuairiscigh muid roimhe seo go spreagann G. duodenalis eischeallach gníomhachtú núicléatídí ceangailteacha receptor 3 (NLRP3) atá cosúil le oligomerization intracellular agus rialaíonn sé freagairtí athlastacha an óstaigh trí secretion vesicle extracellular (EV).Mar sin féin, tá patrúin mhóilíneacha cruinne an EV duodenococcal EV (GEV) a bhaineann le pataigin a bhaineann leis an bpróiseas seo agus ról an NLRP3 inflammasome i giardiasis fós le soiléiriú.
Tógadh plasmids slonn eucaryotic athchuingreach pcDNA3.1(+)-alpha-2 agus alfa-7.3 giardins i GEV, aistríodh go macrophages peritoneal bunscoile luch, agus braitheadh ​​​​trí thomhas an sprioc-mhóilín athlasadh caspase-1.Scrúdaíodh an leibhéal slonn p20..Aithníodh G. duodenalis alpha-2 agus alfa-7.3 giardines ar dtús trí thomhas NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 agus caspase-1 p20), secretion IL.Leibhéil 1β, leibhéil oligomerization de phróitéin chonaic apoptotic (ASC), agus logánú imdhíonfluaraiseach NLRP3 agus ASC.Rinneadh measúnú ansin ar ról an NLRP3 inflammasome i pataigineacht G. duodenalis ag baint úsáide as lucha inar cuireadh bac ar ghníomhachtú NLRP3 (lucha blocáilte NLRP3) agus rinneadh monatóireacht ar athruithe paiteolaíocha i meáchan coirp, ualach seadánacha duodenal, agus fíocháin duodenal.Ina theannta sin, rinneamar imscrúdú ar cibé an spreagann hiardines alfa-2 agus alfa-7.3 secretion IL-1β in vivo tríd an NLRP3 inflammasome agus chinneamar ról na móilíní seo i bpataigineacht G. duodenalis i lucha.
Spreagann giairdíní Alfa-2 agus alfa-7.3 gníomhachtú an NLRP3 inflammatory in vitro.Mar thoradh air seo gníomhachtú p20 caspase-1, méadú ar leibhéil léirithe próitéiní NLRP3, pro-IL-1β, agus pro-caspase-1, méadú suntasach ar secretion IL-1β, foirmiú spotaí ASA sa cíteaplasma, agus ionduchtú oligomerization ASA.Athlasadh NLRP3 Méadaíonn caillteanas penile pataigineacht G. duodenalis i lucha.Léirigh lucha a ndearnadh cóireáil orthu le cysts le gavage ó lucha a raibh bac NLRP3 orthu méadú ar líon na trophozoites agus damáiste mór don villi duodenal, arb iad is sainairíonna iad criptí necrotic le crapadh agus brainseach.Tá sé léirithe ag turgnaimh in vivo gur féidir le giardines alfa-2 agus alfa-7.3 secretion IL-1β a chothú tríd an inflammasome NLRP3, agus laghdaigh imdhíonadh le giardines alfa-2 agus alfa-7.3 pataigineacht G. duodenalis i lucha.
Le chéile, tugann torthaí an staidéir seo le fios go n-eascraíonn giardia alfa-2 agus alfa-7.3 athlasadh óstach NLRP3 agus go laghdaítear ionfhabhtaíocht G. duodenalis i lucha, atá ina spriocanna geallta chun giardiasis a chosc.
Is parasite protozoan extracellular é Giardia duodenum a chónaíonn sa intestine beag agus is cúis le 280 milliún cás giardiasis le buinneach go bliantúil, go háirithe i measc leanaí óga i dtíortha i mbéal forbartha [1].Éiríonn daoine ionfhabhtaithe le huisce óil nó le bia atá éillithe le cysts M. duodenum, a théann isteach sa bholg ansin agus eisfhearadh sna súnna gastric.Giardia duodenum trophozoites gabháil leis an epithelium duodenal, is cúis nausea, vomiting, buinneach, pian bhoilg, agus cailliúint meáchain.Tá daoine aonair a bhfuil easpa imdhíonachta agus fiobróis chisteach acu i mbaol ionfhabhtaithe.Is féidir ionfhabhtú tarlú freisin trí ghnéas béil agus anal [2].Is iad drugaí cosúil le metronidazole, tinidazole, agus nitazoxanide na roghanna cóireála is fearr le haghaidh ionfhabhtuithe duodenal [3].Mar sin féin, is cúis le fo-iarsmaí díobhálacha mar nausea, carcinogenesis, agus géineatocsaineacht na drugaí ceimiteiripe seo [4].Dá bhrí sin, is gá straitéisí níos éifeachtaí a fhorbairt chun ionfhabhtú G. duodenalis a chosc.
Is aicme de choimpléisc próitéin chitosólacha iad inflammasomes atá mar chuid den fhreagra imdhíonachta dúchasach, a chabhraíonn le cosaint a dhéanamh i gcoinne ionradh pataigin agus idirghabháil a dhéanamh ar fhreagraí athlastacha [5].I measc na inflammasomes seo, rinneadh staidéar forleathan ar oligomerization ceangailteach nucleotide (NOD) receptor 3 (NLRP3) oligomerization ceangailteach nucleotide (NLRP3) cosúil le nucleotide-mhaith inflammasome toisc gur féidir é a bhrath ag patrúin móilíneacha éagsúla pataigin / damáiste (PAMP/). DAMP), aithníonn, gníomhaíonn sé an córas imdhíonachta dúchasach.agus rialaíonn homeostasis intestinal i go leor galair athlastacha [6,7,8].Tá sé comhdhéanta den receptor aitheanta patrún (PRR) NLRP3, adapter apoptotic spotted próitéin (ASC), agus éifeachtóir procaspase-1 nó procaspase-11.Feidhmíonn an inflammasome NLRP3 mar óstach i gcoinne ionradh pataigin, mar a breathnaíodh i Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], agus staidéir Leishmania.[11], ach tuairiscíodh freisin go gcuireann gníomhachtú an NLRP3 inflammasome teorainn le freagraí imdhíonachta cosanta agus go gcuireann sé le dul chun cinn galair, mar shampla, i péisteanna [12].Bunaithe ar ár dtorthaí roimhe seo, thuairiscigh muid go spreagann G. duodenalis extracellular gníomhachtú intracellular athlasadh NLRP3 agus modhnaíonn sé freagairtí athlastacha óstacha trí vesicles extracellular (EVs) a scaoileadh [13].Mar sin féin, tá ról an NLRP3 inflammasome in ionfhabhtú G. duodenalis in vivo fós le cinneadh.
Cuireadh síos ar Giardins ar dtús mar chomhpháirteanna struchtúracha den G. duodenalis cytoskeleton agus tá ról tábhachtach acu i motility trophozoite agus gabháil cille epithelial sa stéig bheag.Chun oiriúnú níos fearr don chomhshaol agus a n-pataigineacht a mhéadú, d'fhorbair G. duodenalis trophozoites struchtúr uathúil cítea-chnámharlaigh comhdhéanta de 8 flagella, 1 lárchorp, agus 1 diosca ventral [14].Úsáideann trophozoites Giardia duodenum a gcíteosnámhar chun an intestine beag uachtarach a bhriseadh, go háirithe an duodenum, agus gabháil le enterocytes.Téann siad ar imirce i gcónaí agus ag gabháil le cealla epithelial ag baint úsáide as meitibileacht cille.Mar sin, tá dlúthghaol idir a gcíteischnámharlach agus a nimhneacht.Is comhpháirteanna den struchtúr cytoskeleton iad giardines atá sainiúil do Giardia duodenum [15] agus roinntear iad i gceithre rang: α-, β-, γ-, agus δ-giardines.Tá 21 ball den teaghlach α-giardin, agus tá cumas cailciam-spleách acu go léir chun fosfailipidí a cheangal [16].Ceanglaíonn siad an cíteischnámharlach leis an gcillscannán freisin.I ndaoine aonair a bhfuil buinneach orthu de bharr G. duodenalis, tá α-giardins in iúl go mór agus inmunoreactive le linn ionfhabhtú [17].Tá vacsaíní heterologacha bunaithe ar Giardia alfa-1 cosanta i gcoinne giardiasis i lucha agus is antaiginí iarrthóirí féideartha iad d'fhorbairt vacsaíní [18].Feabhsaíonn Alpha-8 giardin, logánaithe sa membrane plasma agus flagella, ach nach bhfuil sa diosca ventral, motility agus ráta fáis trophozoites i G. duodenalis [19].Gabhann Alpha-14 giardin le struchtúir microtubule ar flagella agus cuireann sé isteach ar inmharthanacht G. duodenalis [20].Tá giardine Alfa-11 i láthair go flúirseach ar feadh an saolré, agus déanann ró-bhrú alfa-11 giardine damáiste do G. duodenalis féin [21].Níl sé soiléir, áfach, an bhfuil giardine alfa-2 agus giardine alfa-7.3 cosanta ar ionfhabhtú G. duodenalis agus a gcuid meicníochtaí bunúsacha.
Sa staidéar seo, aistríodh plasmids slonn eucaryotic athchuingreach pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine agus pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine isteach i macrophages peritoneal bunscoile luiche chun óstach NLRP3 a ghníomhachtú.Scrúdaíodh spriocanna inflammacha ansin.Rinneamar measúnú freisin ar ról an NLRP3 inflammasome i bpataigineacht G. duodenalis, rinneamar imscrúdú ar cibé acu an spreagann giairdíní alfa-2 agus alfa-7,3 gníomhachtú an athlasadh in vivo NLRP3, agus chinneamar go bhfuil an dá ról seo ag giairdíní i bpataigineacht na giairdíní. G. duodenalis.Ba é an comhsprioc a bhí againn ná spriocanna geallta a fhorbairt chun ionfhabhtú G. duodenalis a chosc.
Ceannaíodh lucha de chineál fiáin (WT) C57BL/6 baineann idir 5–8 seachtaine d’aois ó Ionad Ainmhithe Turgnamhach Liaoning Changsheng (Liaoning, an tSín).Bhí rochtain saor in aisce ag lucha ar uisce, fuair siad bia aimridithe agus coinníodh iad i dtimthriall éadrom/dorcha 12/12 uair an chloig.Roimh an ionfhabhtú, fuair lucha antaibheathaigh ad libitum in uisce óil arna fhorlíonadh le ampicillin (1 mg / mL), vancomycin (1 mg / mL), agus neomycin (1.4 mg / mL) (go léir a ceannaíodh ó Shanghai, an tSín, orgánaigh shaorga) [ 22 ].].Bhí lucha a chaill an cumas ithe agus ól ar feadh > 24 uair an chloig agus a chaill ≥ 20% de mheáchan coirp, eotanaithe go daonnachtúil ag dislocation ceirbheacs.
Forlíontar trophozoites WB G. duodenalis (Bailiúchán Cultúir Cineál Meiriceánach, Manassas, SAM) le serum bó féatais 12.5% ​​(FBS; Every Green, Zhejiang, China) agus bile bólachta 0.1% (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA). ).USA) faoi choinníollacha miocróbacha.Bailíodh tróphozoítí comhlíonta ar oighear agus pasáiste ag cóimheas 1:4 le haghaidh atáirgeadh breise.
Spreagadh cysts Giardia duodenum mar a thuairiscítear roimhe seo [23], baineadh trophozoites sa chéim logartamach agus ansin caolaíodh iad le meán astaithe imchochlaithe, pH 7.1 (TYI-S-33 modhnaithe) go tiúchan deiridh de 1 × 106 trophozoites / mL.tiúchan bile 0.05% meánach).Saothraíodh tróphozoites faoi choinníollacha anaeróbach ag 37°C go dtí an chéim fáis logartamach.Athraigh an meán go meán astaithe cyst (pH 7.8; meán TYI-S-33 modhnaithe le tiúchan bile 1%) agus cultúr G. duodenalis ag 37 ° C ar feadh 48-96 uair an chloig, inar breathnaíodh na cysts foirmithe faoi mhicreascóp.Tar éis don chuid is mó de na trófozoítí a bheith spreagtha chun cysts a fhoirmiú, baineadh an meascán saothraithe agus cuireadh ar fionraí é in uisce dí-ianaithe steiriúil chun na trófozoítí a bhí fágtha a líseáil.Rinneadh cistíní a chomhaireamh agus a stóráil ag 4°C le haghaidh anailísí ina dhiaidh sin trí fheadán gastrach i lucha.
Saibhríodh vesicles extracellular Giardia (GEVanna) mar a thuairiscítear roimhe seo [13].Athchóiríodh tróphozoites sa chéim fáis logartamach i meán modhnaithe TYI-S-33 a ullmhaíodh le FBS ídithe eisíomach (Tionscail Bhitheolaíochta, Beit-Haemek, Iosrael) go tiúchan deiridh de 1 × 106 paraisítí/ml agus gor iad ar feadh 12 uair an chloig.scoite amach ón gcultúr supernatant trí lártheifneoiriú ag 2000 g ar feadh 10 nóiméad, 10,000 g ar feadh 45 nóiméad, agus 100,000 g ar feadh 60 nóiméad.Rinneadh deascáin a thuaslagadh i saline maolánach fosfáite (PBS), a chainníochtú ag baint úsáide as trealamh measúnaithe próitéin BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAM) agus a stóráil ag -80 ° C. nó a úsáid go díreach le haghaidh tuilleadh anailíse.
Ullmhaíodh macrophages peritoneal luch bunscoile mar a thuairiscítear roimhe seo [24].Go hachomair, rinneadh lucha (aois 6-8 seachtaine) a instealladh (intraperitoneally [ip]) le 2.5 ml de mheán thioglycol leachtach 2.98% Difco (BD, Franklin Lakes, NJ, SAM) agus chothaigh siad 3-4 palates.Bailíodh fionraí macrophages ó chuas bhoilg na lucha tar éis eotanáis agus lártheifneoirithe 3 huaire ag 1000 g ar feadh 10 nóiméad.Braitheadh ​​cealla bainte trí shreabhmhéadracht ag baint úsáide as an marcóir CD11b go dtí go raibh íonacht na gceall > 98%, ansin curtha le plátaí saothraithe cille 6-tobar (4.5 x 106 cealla / tobar) agus gortha le 10% FBS (Biththionscail) ag 37 ° C.agus 5% CO2.
Baineadh RNA ó trophozoites 1 × 107 i 1 ml d'imoibrí TRIzol (Vazyme, Nanjing, an tSín), baineadh DNA genomic as RNA iomlán G. duodenalis ag baint úsáide as MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, an tSín) agus sintéisíodh DNA comhlántach (cDNA). ag baint úsáide as MonScript RTIIII Super Mix (Monad) de réir threoracha an mhonaróra.
Fuarthas faisnéis seicheamh CDS don sprioc-ghéine G. duodenalis ó GenBank NCBI.Úsáid Primer 5.0 chun primers clónála ar leith gan uaim a dhearadh do gach géine sprice.Tá trí chuid sa réamhphríomhaire (5′-3′): seicheamh forluiteach le veicteoir líneach pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) agus codóin tosaithe ATG agus GNN (mura G é an chéad bhonn).Déantar é seo chun éifeachtacht an léirithe a fheabhsú.Ina theannta sin, ar a laghad 16 bp bonn comhcheangailte (ábhar GC 40-60%/Tm thart ar 55 °C).Tá dhá chuid sa primer droim ar ais (5′-3′), seicheamh forluiteach le veicteoir EcoRV-líneach pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGGCTGGAT) agus bonn comhcheangailte de 16 bp ar a laghad.(gan an dá stad deiridh a áireamh).bunanna) códón cosúil le AA nó GA chun ligean do phlasmaidí athchuingreach a gcuid próitéiní lipéadaithe a chur in iúl).Tá na sraitheanna primer liostaithe i dTábla 1 agus rinne Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, an tSín) iad a shintéisiú.
Méadaíodh na spriocanna ag baint úsáide as Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, China) nó Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) ag baint úsáide as G. duodenalis cDNA ullmhaithe mar theimpléad.An veicteoir abairt eukaryotic plasmid pcDNA3.1 (+) a bhí linearized le EcoRV einsím srianta agus dephosphorylated ag baint úsáide as Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Glanadh blúirí líneacha pcDNA3.1(+) agus blúirí géine sprice aimplithe ag baint úsáide as trealamh íonú glóthach DNA (Tiangen) agus cainníochtaithe ag baint úsáide as Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Rinneadh an blúire pcDNA3.1(+) agus gach blúire géine sprice a athcheangal trí úsáid a bhaint as meascán clónála cóimeála aonair MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, an tSín) agus deimhníodh iad le seicheamhú DNA ag baint úsáide as Comate Bioscience Company Limited (Changchun, an tSín)..
Gineadh plasmidanna saor ó endotoxin pcDNA3.1(+)-alpha-2 agus pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 ag baint úsáide as an Kit Mini Plasmid SanPrep Endotoxin-saor in aisce (Sangon Biotech).Coinníodh an tiúchan os cionn 500 ng/µl lena chinntiú nach gcuirfeadh an EDTA sa mhaolán elution isteach ar an measúnú aistrithe.Saothraíodh macrophages peritoneal luch bunscoile i bplátaí 6-tobar le meán iomlán RPMI 1640 (Tionscail Bhitheolaíochta) ar feadh 12 uair an chloig, ansin nite na cealla 3 huaire i PBS te chun peinicillin agus streiptimícin a bhaint, agus ansin i meán a fhorlíonadh le meán iomlán.Caolaíodh plasmidanna saor ó endotoxin pcDNA3.1(+)-alpha-2 agus pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2.5 μg) i 125 μl de mheán séiream laghdaithe Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Ansin caolaíodh 5 µl imoibrí aistrithe Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) i 125 µl de mheán serum Opti-MEM íseal.Ullmhaigh coimpléisc liposome-DNA tríd an plasmid saor ó endotoxin caolaithe a mheascadh le Lipofectamine 2000 agus ligean don mheascán seasamh ag teocht an tseomra ar feadh 5 nóiméad.Aistrigh na coimpléisc ar leithligh chuig cealla i ngach tobar agus measc go mall.Tar éis 4 uair an chloig, cuireadh 2 ml de mheán iomlán RPMI 1640 in ionad an mheán cultúir cille agus leanadh den chultúr ar feadh 24 uair an chloig.Cuireadh meán saothraithe cille úra leis na cealla agus gor é ar feadh tréimhsí ama éagsúla ag brath ar dhearadh na measúnachta.
Ullmhaíodh samplaí próitéin ó supernatants agus lysates cille mar a thuairiscítear roimhe seo [25].Ba iad na paraiméadair aistrithe membrane le haghaidh pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, agus His-tag ná 200 mA/90 min.Le haghaidh interleukin 1β (IL-1β; T&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, An Eilvéis) agus NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, An Eilvéis) agus 1:5000 ag díriú ar a chlib (Amylet Scientific, Wuhan, an tSín) agus β-actin (Proteintech, Wuhan, an tSín).
Rinneadh tras-nascadh le suberate disuccinimide (DSS) mar a thuairiscítear roimhe seo [26].Nigh cealla 3 huaire le PBS fuar agus lísíodh go hiomlán iad le snáthaid tomhais 27 i maolán imoibrithe 50 µl ASC (pH 8.0) ina raibh 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES agus 125 mM NaHCO3.Rinneadh an meascán a lártheifneoiriú ag 5000 g ar feadh 3 nóiméad agus rinneadh an millíní a uí le 10 µl DSS (25 mM i DMSO) agus maolán imoibrithe 40 µl ASC ar feadh 30 nóiméad ag 37 °C.Tar éis lártheifneoiriú ag 5000 g ar feadh 10 nóiméad, díscaoileadh an millíní i dtuaslagán 40 µl de mhaolán imoibrithe ASC agus 10 µl de mhaolán luchtaithe próitéin 6x (TransGen, Beijing, China), agus ansin múchadh an réiteach ag teocht an tseomra ar feadh 15 nóim., Ansin boil 10 nóiméad.Ansin cuireadh samplaí próitéine faoi blotting an Iarthair ag baint úsáide as antasubstaintí frith-ASC príomhúla (Wanleibio, Shenyang, an tSín) ag cóimheas caolaithe de 1:500.
Tar éis nós imeachta a thuairiscítear roimhe seo [13], baineadh súdairí cultúir cille agus cinneadh secretion an cytokine pro-inflammatory IL-1β ag baint úsáide as an luch IL-1 Beta ELISA trealamh (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Tiontaigh luachanna OD450nm go tiúchain próitéine ag baint úsáide as an gcuar caighdeánach IL-1β.
Rinneadh cealla atá brataithe ar chlúdaigh a nite go réidh 3 huaire i PBS te, socraithe i ndéadaitheoir cille fíocháin (Biosharp, Beijing, an tSín) ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra (RT), i 0.1% Triton X-Permeabilize ag 100 (caolaithe i PBS; Biosharp; ) ar feadh 20 nóiméad ag teocht an tseomra agus bloc in albaimin serum bó-5% (i PBS) ar feadh 2 uair ag teocht an tseomra.Ansin goradh cealla thar oíche ag 4°C le príomhantasubstaintí i gcoinne ASC (caolú 1:100) nó NLRP3 (caolú 1:100), faoi seach, agus IgG(H+L) frith-choine gabhair lipéadaithe Cy3 (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, SAM) nó IgG frith-luch gabhar comhchuingeach FITC (1:400; Earthox) thar oíche ag 37°C sa dorchadas ar feadh 1 uair an chloig.Dathaíodh na núicléis le Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, an tSín) ar feadh 5 nóiméad agus breathnaíodh iad faoi mhicreascóp fluaraiseachta (Olympus Corporation, Tóiceo, an tSeapáin).
Roinneadh lucha i gceithre ghrúpa (n = 7 i ngach grúpa): (i) Grúpa rialaithe diúltach PBS-chóireáilte (PBS amháin; gavage 100 µl/luch PBS agus instealladh laethúil ion-peritoneal ina dhiaidh sin 100 µl/luch PBS 3 huaire níos déanaí)., go leanúnach ar feadh 7 lá);(ii) grúpa rialaithe diúltach cóireáilte le coscaire MCC950 [27] (100 µl/luch trí gavage PBS, 3 uair an chloig ina dhiaidh sin, 10 mg/kg meáchan coirp [BW] MCC950 [i PBS] a riaradh inperitoneally laethúil, fad 7 lá);(iii) Grúpa ionfhabhtaithe G. duodenalis cyst (1.5 x 106 cysts/luch le gavage, 3 uair an chloig níos déanaí, 100 μl/luch PBS riaradh inperitoneally laethúil ar feadh 7 lá);(iv) Grúpa ionfhabhtaithe comhcheangailte cyst G. duodenalis MCC950 grúpa cóireála coscairí (1.5 × 106 cysts/luch tríd an gavage, 10mg/kg meáchan coirp MCC950 intraperitoneally laethúil ar feadh 7 lá ag 3h).Rinneadh monatóireacht laethúil ar mheáchan coirp gach luiche agus rinneadh eotánú ar gach lucha ar an 7ú lá.Gearradh duodenum buaite (fad 3 cm) i bpíosaí beaga i 1 ml PBS, scriosadh cysts thar oíche i PBS ag 4 °C, agus G. duodenalis trophozoites.Rinneadh duodenum úr (1 cm ar fad) a leithlisiú le haghaidh staining hematoxylin agus eosin (S&E).
Roinneadh lucha ina dhá ghrúpa: (i) grúpa rialaithe MOCK agus (ii) grúpa coscairí MCC950.Bhí cúig chóireáil i ngach grúpa (n = 7/grúpa cóireála): (i) grúpa rialaithe diúltach cóireála PBS (PBS amháin; 100 µl/luch PBS, instealladh ionmhatánach (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) grúpa rialaithe plasmid-diúltach (DNA 100 µg/luch, trí instealladh ionmhatánach); (iii) grúpa rialaithe deimhneach ionfhabhtaithe cist duodenalis (1.5 x 106 cysts/luch, trí thomhas) (iv) a grúpa atá cóireáilte le plasmid pcDNA3.1(+)-alfa-2 (DNA 100 μg/luch, trí instealladh ionmhatánach), agus (v) grúpa atá cóireáilte le plasmid pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/luch DNA, tar éis 12 uair an chloig pasáiste, fuair lucha sa ghrúpa coscairí MCC950 instealladh laethúil inperitoneal de MCC950 (meáchan coirp 10 mg/kg) ar feadh 7 lá, agus fuair lucha sa ghrúpa MOCK líon comhionann de chóireáil PBS. Bhí samplaí fola a bailíodh ó na lucha eyeballs agus fágadh thar oíche ag 4 ° C. Rinneadh samplaí de shéiream a leithlisiú trí úsáid a bhaint as measúnacht imdhíonta-nasctha einsíme (ELISA) le haghaidh leibhéil IL-1β agus tomhais orthu.
Roinneadh tríocha cúig lucha i gcúig ghrúpa (n=7/grúpa).Grúpa rialaithe diúltach a bhí i nGrúpa 1 a ndearnadh cóireáil air le PBS: fuair lucha 100 μl de PBS go ionmhatánach agus 3 lá ina dhiaidh sin le gavage.Is grúpa rialaithe dearfach é Grúpa 2 atá ionfhabhtaithe le cistí G. duodenalis: instealladh lucha le 100 μl de PBS, agus 3 lá ina dhiaidh sin cuireadh 1.5 x 106 cysts/luch instealladh intragastrach.Tríú grúpa – imdhíonadh plasmaid le pcDNA3.1(+) i gcomhcheangal le grúpa rialaithe d’ionfhabhtú an chisteach duodenal: fuair lucha 100 µg de DNA plasmid pcDNA3.1(+)(im) ó bhéal, 1.5×106 cysts/luch 3 i gcás roinnt mhaith laethanta.Ba iad Grúpaí 4 agus 5 athchuingreach pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine plasmid nó pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid i gcomhar le ionfhabhtú G. duodenalis cyst.Grúpa turgnamhach: fuair lucha 100 µg de pcDNA3.1(+)-giardine plasmid DNA (im), ansin 3 lá ina dhiaidh sin, cuireadh 1.5 × 106 cysts / luch instealladh tríd an gavage.Rinneadh monatóireacht ar mheáchan coirp gach luch tar éis an chist G. duodenalis a thabhairt isteach tríd an bhfeadán.Bailíodh duodenum úr le haghaidh ualach seadánacha a thomhas agus anailís staining HE.
Rinneadh anailís ar athruithe histeapaiteolaíocha de réir nós imeachta a foilsíodh roimhe seo [30].Socraíodh duodenum úr le fostóir cille fíocháin, leabaithe i pairifín, gearrtha i gcodanna 4 μm, dhaite le H&E agus anailísithe faoi mhicreascóp solais.Rinne paiteolaí aineolach ar an gcóireáil athruithe paiteolaíocha ionadaíocha i seacht rannóg fíocháin ó sheacht lucha neamhspleácha a mheas agus gabhadh iad ag formhéadú 200x.Rinneadh fad an villi agus doimhneacht na n-crypts a thomhas de réir na modhanna a thuairiscítear roimhe seo.
Fuarthas na torthaí in vitro agus in vivo i dtrí chóip.Gineadh graif ag baint úsáide as GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SAM).Rinneadh anailís ar dhifríochtaí idir dhá ghrúpa de réir t-tástála, agus rinneadh anailís ar dhifríochtaí idir grúpaí ≥3 trí anailís aontreo ar athraitheacht (ANOVA) ag baint úsáide as bogearraí SPSS (leagan 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, SAM).Rinneadh anailís ar shonraí maidir le haonchineálacht athraithis ag baint úsáide as tástáil Levene agus ansin tástáil post hoc Bonferroni (B).Sloinntear suntas mar P<0.05, P<0.01, agus P<0.001 (níl suntasach [ns]) (P>0.05).
Léirigh ár n-anailís roimhe seo ar phróitéamaíocht GEV in Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) go bhféadfadh go leor spriocanna a bheith páirteach i ngníomhú bealaí comharthaíochta athlastacha [13].Roghnaíomar dhá sprioc a bhfuil gealladh fúthu, giardins alfa-2 agus alfa-7.3, chun na móilíní seo a mhéadú agus iad a úsáid chun veicteoir slonn eucaryotic pcDNA3.1(+) a thógáil.Tar éis seicheamhú, aistríodh plasmids slonn athchuingreach pcDNA3.1(+)-alpha-2 agus alfa-7.3 giardine isteach i macrófaigí peritoneal lucha príomhúla, agus aithníodh an próitéin sínithe caspase-1 p20 athlasadh (blúire de caspase-1 gníomhachtaithe). mar phríomh-mhóilíní a d'fhéadfadh athlasadh a spreagadh.Léirigh na torthaí gur féidir giardines alfa-2 agus alfa-7.3 aslú p20 caspase-1 slonn cosúil le GEV.Níor aimsíodh aon éifeacht ar ghníomhachtú caspase-1 sa rialú diúltach neamhchóireáilte (PBS amháin) agus sa rialú plasmaid pcDNA3.1(+) (Fíor 1).
Gníomhachtú caspase-1 p20 a thomhas ag pcDNA3.1(+)-alfa-2 agus giardins alfa-7.3.Aistríodh plasmidí slonn eucaryotic athchuingreach pcDNA3.1(+)-alfa-2 agus alfa-7.3 giairdíní (os cionn gach lána) go macrophages peritoneal luiche bunscoile agus baineadh súiteáin chultúir 24 uair ina dhiaidh sin.Baineadh úsáid as blotáil an Iarthair chun leibhéil slonn na próitéine inflammasome caspase-1 p20 sínithe a thomhas.Baineadh úsáid as an ngrúpa cóireála PBS amháin (lána C) agus an grúpa monotherapy pcDNA3.1 (+) (lána pcDNA3.1) mar rialú diúltach, agus úsáideadh an grúpa cóireála GEV mar rialú dearfach.Deimhníodh léiriú na próitéine athchuingreach trí chlib histidine a bhrath i ngach próitéin, agus ba iad na bannaí próitéine a raibh súil leo ná alfa-2 giardine (38.2 kDa) agus alfa-7.3 giardine (37.2 kDa).Feicil eischeallacha GEV, Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), veicteoir líneach EcoRV, SUP, comhshnaidhm
Chun a chinneadh an spreagann alfa-2 giardine agus alfa-7.3 giardine slonn p20 caspase-1 agus an bhfuil ról acu maidir le freagairt athlastach NLRP3 an ósta a ghníomhachtú, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine agus pcDNA3.1(+)-alpha Aistríodh -7.3 giardin go macrophages peritoneal luch bunscoile le DNA plasmid athchuingreach, agus socraíodh leibhéil léirithe, logánú, agus oligomerization na bpríomhphróitéiní athlastacha NLRP3.Sa turgnamh seo, baineadh úsáid as GEV mar an grúpa rialaithe dearfach, agus ba é an grúpa gan chóireáil (PBS amháin) nó an grúpa cóireála aistrithe pcDNA3.1(+) an grúpa diúltach.Léirigh na torthaí, mar atá sa ghrúpa GEV, gur tháinig suasrialú NLRP3, pro-IL-1β agus giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 agus giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 agus procaspase-1 agus gníomhachtú caspase-1 (Fíor 2a).Ina theannta sin, chothaigh an dá giairdín secretion suntasach IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; giardine alfa-2: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alfa-7.3 giairdín: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Fíor 2b).Bhí formhór na bpróitéiní ASC monaiméireacha sa ghrúpa gan chóireáil nó sa ghrúpa cóireála a aistríodh leis an plasmid pcDNA3.1(+), i gcodarsnacht le pcDNA3.1(+)-alpha-2 nó pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giardín.Tharla oligomerization ASC i DNA plasmid athchuingreach an ghrúpa nó an ghrúpa rialaithe dearfach GEV, ag taispeáint foirm oligomeric (Fíor 2c).Tugann na réamhshonraí seo le fios gur féidir le giardine alfa-2 agus alfa-7,3 giardine gníomhachtú athlasadh NLRP3 a spreagadh.Léirigh staidéir imdhíonfluaraiseach ina dhiaidh sin ar logánú ASC agus NLRP3 go raibh an próitéin ASC scaipthe ar fud an chíteaplasma sa ghrúpa rialaithe diúltach agus go raibh sé le feiceáil mar chomhartha ponc nuair a spreagadh pcDNA3.1(+)-alpha-2 le giardine nó pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 grúpa giairdín nó grúpa rialaithe deimhneach GEV (Fíor 2d).Sna grúpaí rialaithe diúltacha agus pcDNA 3.1 cóireáilte le plasmid, níor aimsíodh comhartha próitéin NLRP3, agus ponc comhartha fluaraiseacha mar fhreagra ar pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine nó pcDNA3.1 (+) -alfa-7.3 braitheadh..giardine le fáil sa cíteaplasma nó nuair a spreagadh an HEV (Fíor 2e).Léiríonn na sonraí seo freisin go ngníomhaíonn G. duodenalis giardin alpha-2 agus giardin alpha-7.3 an inflammasome NLRP3 i macrophages peritoneal bunscoile luch.
gníomhaíonn pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin agus pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin an NLRP3 inflammasome i macrophages peritoneal luch.Aistrigh an slonn eucaryotic athchuingreach plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin agus pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin go macrophages agus cealla peritoneal murine bunscoile, nó buain an ollnóva laistigh de 24 h chun anailís a dhéanamh ar chaint, oligomerization , rún.agus logánú príomhphróitéiní athlastacha.Baineadh úsáid as an ngrúpa PBS-amháin (C) agus an grúpa cóireála aonair pcDNA3.1 (+) mar an rialú diúltach, agus úsáideadh an grúpa cóireála GEV mar ghrúpa dearfach.a Príomhphróitéiní athlastacha NLRP3, lena n-áirítear NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, agus p20 caspase-1, braitheadh ​​​​blotáil an Iarthair.b Socraíodh na leibhéil secretion IL-1β sna supernatants trí úsáid a bhaint as measúnacht imdhíon-ionsorbent einsím-nasctha (ELISA).Rinneadh anailís ar dhifríochtaí idir grúpaí rialaithe agus trialacha trí anailís aontreo ar athraithis (ANOVA) ag baint úsáide as leagan bogearraí SPSS 22.0.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha idir grúpaí **P<0.01 agus ***P<0.001.c Socraíodh leibhéil oligomerization ASC i millíní trí anailís tras-nasctha DSS, agus úsáideadh leibhéil ASC i lísáití cille mar rialú luchtaithe.d Amharcléiriú ar logánú ISC ag baint úsáide as imdhíonfluaraiseacht.e Baineadh úsáid as imdhíonfluaraiseacht chun logánú NLRP3 a léirshamhlú.ASC, apoptotic speck-mhaith próitéin;IL, idirleukin;NLRP3, nucleotide-ceangailteach oligomerization-mhaith receptor 3;ns, gan a bheith suntasach (P > 0.05)
Gníomhaíonn an dá G. duodenalis agus na GEVanna a secretes sé an NLRP3 inflammasome agus rialaíonn siad freagairtí athlastacha an óstaigh in vitro.Mar sin, tá ról an NLRP3 inflammasome i pataigineacht G. duodenalis fós doiléir.Chun an tsaincheist seo a imscrúdú, dhearamar turgnamh idir lucha a bhí ionfhabhtaithe le cyst G. duodenalis agus lucha ionfhabhtaithe le cóireáil inhibitor G. duodenalis cyst + MCC950 agus rinneamar comparáid idir léiriú inflammasome NLRP3 nuair a bhí siad ionfhabhtaithe le cyst G. duodenalis.Taispeántar scéim mhionsonraithe den turgnamh in Fíor 3a.Rinneadh monatóireacht ar athruithe i meáchan coirp lucha i ngrúpaí cóireála éagsúla ar feadh 7 lá tar éis ionfhabhtú le cysts, agus léirítear na torthaí i bhFíor 3b.I gcomparáid leis an ngrúpa a ndearnadh cóireáil orthu le PBS íon, léirigh na torthaí (i) gur tháinig laghdú ar mheáchan coirp lucha a bhí ionfhabhtaithe le cyst G. duodenalis ó lá 3 go lá 7 tar éis ionfhabhtú;(ii) ní raibh aon éifeacht shuntasach ag cóireáil leis an gcoscóir MCC950 ar mheáchan coirp na lucha..I gcomparáid leis an ngrúpa ionfhabhtaithe aonair, laghdaigh BW an ghrúpa ionfhabhtaithe duodenal ar déileáladh leo le MCC950 go céimeanna éagsúla (Lá 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Lá 2: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0.4602, P <0.0001; Lá 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; Lá 4: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052; (3, 24)=0.6497, P=0.0645; Lá 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175; Lá 7: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202).Léiríonn na sonraí seo go gcosnaíonn an inflammasome NLRP3 lucha ó meáchain caillteanas suntasach sna céimeanna tosaigh (2-4 lá) d'ionfhabhtú duodenal.Bhí sé mar aidhm againn ansin G. trophozoites duodenalis a bhrath i sreabhán laisce duodenal agus léirítear na torthaí i bhFíor 3c.I gcomparáid leis an ngrúpa ionfhabhtú G. duodenalis cyst, tháinig méadú suntasach ar líon na trophozoites sa duodenum tar éis blocáil NLRP3 inflammasome (t(12) = 2.902, P = 0.0133).Léirigh fíocháin duodenal daite le HE, i gcomparáid le rialú diúltach cóireáilte le PBS agus MCC950 amháin: (i) Bhí damáiste don villi duodenalis mar thoradh ar ionfhabhtú cyst duodenalis (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0488). ) agus atrophy cripte (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) duodenum ó lucha atá ionfhabhtaithe le cysts G. duodenalis agus cóireáilte le coscairí MCC950.Rinneadh damáiste do villi duodenal agus marbh (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) le atrophy agus brainseach cript (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fíor 3d- f) .Tugann na torthaí seo le fios go bhfuil ról ag an NLRP3 inflammasome maidir le pataigineacht G. duodenalis a laghdú.
Ról NLRP3 inflammasome in ionfhabhtú Giardia duodenum.Gabháladh lucha (iv) le cistí dé-anocócacha agus ansin cóireáilte le MCC950 (ip) nó gan iad.Baineadh úsáid as grúpaí cóireála aonair le PBS nó MCC950 mar rialuithe.Grúpa turgnamhach agus córas cóireála.b Rinneadh monatóireacht ar mheáchan coirp na lucha i ngach ceann de na grúpaí cóireála éagsúla ar feadh 7 lá.Rinneadh anailís ar an difríocht idir grúpa ionfhabhtaithe G. duodenalis agus grúpa cóireála ionfhabhtaithe G. duodenalis + MCC950 trí thástáil t ag baint úsáide as leagan bogearraí SPSS 22.0.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha ag *P<0.05, **P<0.01, nó ***P<0.001.c Socraíodh ualach seadánacha trí líon na dtrófozoítí a chomhaireamh i sreabhán laisce duodenal.Rinneadh anailís ar an difríocht idir grúpa ionfhabhtaithe G. duodenalis agus grúpa cóireála ionfhabhtaithe G. duodenalis + MCC950 trí thástáil t ag baint úsáide as leagan bogearraí SPSS 22.0.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha ag *P < 0.05.d Torthaí staining hematocsailín agus eoisin (H&E) ar histeapaiteolaíocht duodenal.Léiríonn saigheada dearga damáiste don villi, léiríonn saigheada glasa damáiste do na crypts.Barra scála: 100 µm.e, f Anailís staitistiúil ar airde villus duodenal agus airde crypt luiche.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha ag *P<0.05 agus **P<0.01.Tógtar na torthaí ó 7 dturgnaimh bhitheolaíocha neamhspleácha.BW, meáchan coirp;ig, bealach seachadta intragastrach;ip, bealach seachadta intraperitoneal;ns, gan a bheith suntasach (P > 0.05);PBS, saline maolánach fosfáit;WT, cineál fiáin
Is sainmharc gníomhachtaithe athlasadh é an secretion IL-1β.Chun a chinneadh an ngníomhaíonn G. duodenalis alfa-2 giardine agus alfa-7.3 giardine an t-óstach NLRP3 inflammasome in vivo, d'úsáideamar lucha WT neamhchóireáilte (grúpa sham) agus lucha bactha inflammasome NLRP3 (grúpa cóireála coiscthe MCC950).Taispeántar scéim mhionsonraithe den turgnamh i bhFíor 4a.Is éard a bhí i ngrúpaí turgnamhacha ná lucha a ndearnadh cóireáil orthu le PBS, cóireáil chist G. duodenalis le gavage, instealladh ionmhatánach de pcDNA3.1, agus instealladh ionmhatánach de pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine nó pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Ar an 7ú lá tar éis riarachán ionmhatánach an plasmid athchuingreach, bailíodh serum agus socraíodh leibhéal IL-1β i ngach grúpa.Mar a léirítear i bhFíor 4b, sa ghrúpa MOCK: (i) i gcomparáid leis an ngrúpa PBS, ní raibh aon éifeacht shuntasach ag cóireáil pcDNA3.1 ar secretion IL-1β (ANOVA, F(4.29) = 4.062, P = 0.9998), áfach, Ardaíodh secretion IL-β go suntasach sa ghrúpa cyst G. duodenalis (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) giardine pcDNA3.1-alpha-2 agus pcDNA3.1- Mhéadaigh instealladh ionmhatánach de alfa-7.3 giardine go suntasach leibhéil serum IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 leibhéil arda de secretion IL -1β spreagtha sa ghrúpa instealladh ionmhatánach pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .I gcomparáid le gach grúpa sa ghrúpa cóireála MCC950 agus an grúpa MOCK: (i) laghdaigh leibhéil secretion IL-1β sa ghrúpa rialaithe PBS agus an grúpa rialaithe pcDNA3.1 go pointe áirithe tar éis an t-inhibitor MCC950 a bhlocáil, ach ní raibh an difríocht ann. suntasach (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) tar éis MCC950 a bhlocáil., laghdaíodh secretion IL-1β go suntasach sa ghrúpa G. duodenalis cyst-ionfhabhtaithe, an grúpa giardine pcDNA3.1-alpha-2, agus an grúpa giardine pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9). , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOVA, F(9, ) = 3.540, P = 0.0164).Tugann na torthaí seo le fios go ndéanann alfa-2 giardine agus alfa-7.3 giardine idirghabháil ar ghníomhachtú an NLRP3 inflammasome in vivo.
pcDNA3.1(+)-gníomhaíonn giardines an t-óstach NLRP3 inflammasome in vivo.Rinneadh imdhíonadh ar lucha (IM) le slonn eucaryotic athchuingreach plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine nó pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine agus ansin déileáladh leo le MCC950 (ip; grúpa MCC950) nó nach ea (grúpa caochadán ).Baineadh úsáid as an ngrúpa cóireála plasmid PBS nó pcDNA3.1(+) mar rialú diúltach, baineadh úsáid as an ngrúpa cóireála cyst G. duodenalis mar rialú dearfach.Grúpa turgnamhach agus córas cóireála.b Rinneadh leibhéil serum IL-1β i lucha a thomhas ar an lá 7 le measúnacht ELISA.Rinneadh anailís ar na difríochtaí idir grúpaí sa ghrúpa MOCK ag baint úsáide as ANOVA aontreo, agus rinneadh anailís ar na difríochtaí idir an grúpa MOCK agus an grúpa MCC950 ag baint úsáide as an t-tástáil ar leagan bogearraí SPSS 22.0.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha idir grúpaí cóireála sa ghrúpa MOCK, *P<0.05 agus ***P<0.001;Léiríonn comharthaí dollar ($) difríochtaí suntasacha idir gach grúpa sa ghrúpa MOCK agus an grúpa MCC950 ag P<0.05.Torthaí na seacht dturgnaimh bhitheolaíocha neamhspleácha.i, instealladh ionmhatánach, ns, ní suntasach (P > 0.05)
Chun imscrúdú a dhéanamh ar éifeacht gníomhachtú alfa-2 agus alfa-7.3 giardine-mediated an inflammasome óstaigh NLRP3 ar ionfhabhtaíocht G. duodenalis, d'úsáideamar lucha WT C57BL/6 agus rinneamar giardine alfa-2 agus giardine alfa-7.3 a instealladh.rinneadh an plasmid a instealladh go ionmhatánach, tar éis 3 lá trí fheadán gastric an chist G. duodenalis, agus ina dhiaidh sin breathnaíodh na lucha ar feadh 7 lá.Taispeántar scéim mhionsonraithe den turgnamh in Fíor 5a.Rinneadh meáchan coirp gach luch a thomhas gach lá, bailíodh samplaí d'fhíocháin duodenal úr ar an 7ú lá tar éis riarachán trí fheadán gastrach, rinneadh líon na trophozoites a thomhas, agus breathnaíodh athruithe histeapaiteolaíocha.Mar a léirítear i bhFíor 5b, le méadú ar an am beathaithe, mhéadaigh BW na lucha i ngach grúpa de réir a chéile.Thosaigh MT na lucha ag laghdú ar an 3ú lá tar éis riarachán intragastric de G. cysts duodenalis, agus ansin méadú de réir a chéile.Laghdaigh gníomhachtú an inflammasome NLRP3 de bharr instealladh ionmhatánach de alfa-2 giardine agus alpha7.3 giardine meáchain caillteanas caolaithe go suntasach i lucha (Lá 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P). = 0 .9754 Lá 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0.9987 Lá 2: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Lá 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; Lá 3 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine(, ANOVA, 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Lá 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083; Lá 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Lá 4: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, Lá 5: pcDNA3.1-alfa - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Lá 5: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Lá 6: pcDNA3 . alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Lá 6: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Lá 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001 Lá 7: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.5369, P <0.0001).Rinneadh measúnú ar an ualach seadánacha sa duodenum (Fíor 5c).I gcomparáid leis an rialú dearfach neamhchóireáilte agus an grúpa a instealladh leis an veicteoir pcDNA3.1 folamh, laghdaíodh líon na trophozoites G. duodenalis go suntasach sna grúpaí a instealladh le α-2 giardine agus α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alfa -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P <0.0001).Ina theannta sin, bhí giardine alfa-7.3 níos cosanta i lucha ná giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Taispeántar torthaí staining HE i bhfíor.5d–f.Bhí níos lú loit fíocháin duodenal ag lucha a instealladh le giardine alfa-2 agus alfa-7.3 giardine, arna léiriú ag damáiste villus, i gcomparáid le lucha a instealladh le G. duodenalis agus lucha a instealladh le G. duodenalis i gcomhar le veicteoir pcDNA3 folamh .1 Zúmáil.(pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 nó P = 0.0068; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 nó P = 0.0055) agus atrophy cript laghdaithe (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 nó P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 nó P = 0.0191).Tugann na torthaí seo le fios go laghdaíonn alfa-2 giardine agus alfa-7,3 giardine ionfhabhtaíocht G. duodenalis trí ghníomhachtú an NLRP3 inflammasome in vivo.
Ról pcDNA3.1(+)-giardins in ionfhabhtú G. duodenalis.Rinneadh imdhíonadh ar lucha (IM) le plasmid slonn eucaryotic athchuingreach pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine nó pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine agus ansin tugadh dúshlán dóibh le cysts G. duodenalis (ig).Baineadh úsáid as an ngrúpa PBS agus an grúpa cóireála cyst duodenal pcDNA3.1(+) mar ghrúpaí rialaithe diúltacha, agus úsáideadh an grúpa cóireála cyst duodenal mar ghrúpa rialaithe dearfach.Grúpa turgnamhach agus córas cóireála.b Rinneadh monatóireacht ar MT na lucha i ngach ceann de na grúpaí cóireála éagsúla ar feadh 7 lá tar éis an dúshlán.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha idir grúpaí sa ghrúpa G. duodenalis agus an grúpa giardine pcDNA3.1(+)-alfa-2, *P < 0.05, **P < 0.01, agus ***P < 0.001;léiríonn comhartha an dollar ($) difríocht shuntasach idir gach grúpa G. duodenalis agus an grúpa jardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3, $$P<0.01 agus $$$P<0.001.c Socraíodh ualach seadánacha trí líon na trophozoites a chomhaireamh i 1 ml de lavage duodenal ón duodenum (3 cm ar fad) agus arna shloinneadh mar líon na paraisítí in aghaidh an cm den duodenum.Rinne ANOVA aon-bhealach anailís ar na difríochtaí idir an grúpa ionfhabhtaithe G. duodenalis, an grúpa giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2, agus an grúpa giardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ag baint úsáide as leagan bogearraí SPSS 22.0.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha ag **P<0.01 agus ***P<0.001.d Athruithe histeapaiteolaíocha sa duodenum.Léiríonn saigheada dearga damáiste don villi, léiríonn saigheada glasa damáiste do na crypts.Barra scála: 100 µm.e, f Anailís staitistiúil ar airde villus duodenal luiche (e) agus airde crypt (f).Rinneadh anailís ar na difríochtaí idir grúpaí i bhFíor 1d ag ANOVA aontreo ag baint úsáide as leagan bogearraí SPSS 22.0.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha ag *P<0.05 agus **P<0.01.Torthaí na seacht dturgnaimh bhitheolaíocha neamhspleácha.ns, gan a bheith suntasach (P > 0.05)
Is seadán intestinal aitheanta é Giardia duodenum de dhaoine agus mamaigh eile is cúis le giardiasis.In 2004, cuireadh san áireamh é i dTionscnamh Galair Dearmadta an EDS mar gheall ar a leitheadúlacht ard thar 6 bliana, go háirithe i bpobail a bhfuil stádas socheacnamaíoch íseal acu [32].Tá ról ríthábhachtach ag an gcóras imdhíonachta dúchasach sa fhreagra imdhíonachta ar ionfhabhtú G. duodenalis.Tuairiscíodh go bhfuil macrophages luiche ag engulf agus marú G. duodenalis trí ghaistí extracellular a scaoileadh [33].Léirigh ár staidéir roimhe seo go ngníomhaíonn G. duodenalis, parasite extracellular neamh-ionrach, p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, agus cosáin athlastacha comharthaíochta NLRP3 i macrophages luiche chun freagairtí athlastacha óstach a rialáil, agus féadfaidh scaoileadh GEV an próiseas seo a fheabhsú.13], 24].Mar sin féin, tá na PAMPanna cruinne a bhaineann le NLRP3 athlasadh rialaithe inflammasome i GEV agus ról NLRP3 inflammasome i giardiasis fós le soiléiriú.Chun solas a chur ar an dá cheist seo, rinneamar an staidéar seo.
Tá an inflammasome NLRP3 suite i gcíteaplasma na gcealla imdhíonachta agus is féidir é a ghníomhachtú le cáithníní éagsúla cosúil le criostail aigéad uric, tocsainí, baictéir, víris agus paraisítí.I staidéir baictéaracha, aithníodh tocsainí mar PAMPanna tábhachtacha a ghníomhaíonn braiteoirí athlastacha, rud a fhágann athlasadh agus bás cille [34].Spreagann roinnt tocsainí struchtúracha éagsúla, mar shampla hemolysin ó Staphylococcus aureus [35] agus Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) ó enterotoxin (NHE) [37], gníomhachtú athlasadh NLRP3.Tá sé léirithe ag staidéir víreasacha go bhfuil próitéiní virulence cosúil le próitéin SARS-COV-2 clúdach (E) [38] agus próitéin víreas Zika NS5 [39] ina PAMPanna tábhachtacha aitheanta ag an receptor NLRP3.I staidéir parasite, tuairiscíodh go bhfuil go leor paraisítí bainteach le gníomhachtú inflammasome óstach, mar shampla Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], agus Leishmania [42].Tá na próitéiní granule dlúth GRA35, GRA42, agus GRA43, a bhaineann le virulence Toxoplasma gondii, ag teastáil le haghaidh ionduchtú pyroptosis i macrophages francach Lewis [43].Ina theannta sin, tá roinnt staidéir Leishmania tar éis díriú ar mhóilíní aonair a bhfuil baint acu leis an NLRP3 inflammasome, mar shampla membrane parasite lipophosphoglycan [44] nó since metalloprotease [45].I measc na dteaghlach géinte alfa-giardin cosúil le anexin, tá sé léirithe go bhfuil giardin alfa-1 ina iarrthóir vacsaíne féideartha a sholáthraíonn cosaint i gcoinne G. duodenalis i múnla luch [18].In ár staidéar, roghnaigh muid G. duodenalis virulence fachtóirí alfa-2 agus alfa-7,3 giardines, atá uathúil do giardia ach i bhfad níos lú tuairiscithe.Clónáladh an dá sprice ghéin seo isteach i veicteoir córais abairte eucaryotic pcDNA3.1(+) chun anailís a dhéanamh ar ghníomhachtú athlasadh.
Inár múnla luch, feidhmíonn blúirí caspase scoilte mar mharcóirí ar ghníomhachtú athlastach.Nuair a dhéantar é a spreagadh, idirghníomhaíonn NLRP3 le ASC, earcaíonn sé procaspases, agus gineann sé caspases gníomhacha a scoilteann pro-IL-1β agus pro-IL-18 go aibí IL-1β agus IL-18, faoi seach -18.Is teaghlach caomhnaithe de phróitéisí cistéin iad caspáis athlastacha (caspases-1, -4, -5 agus -11) atá ríthábhachtach le haghaidh cosanta dúchasach agus tá baint acu le hathlasadh agus le bás cille cláraithe [46].Gníomhachtaítear Caspase-1 ag inflammasomes canonical [47], agus scoilttear caspase-4, -5, agus -11 le linn inflammasomes aitíopúla a fhoirmiú [48].Sa staidéar seo, d'úsáideamar macrophages peritoneal luch mar mhúnla agus rinneamar imscrúdú ar p20 caspase-1 cleaved caspase-1 mar chomhartha ar ghníomhachtú athlasadh óstach NLRP3 i staidéir ar ionfhabhtú G. duodenalis.Léirigh na torthaí go bhfuil go leor alfa-giardins freagrach as gníomhachtú tipiciúil athlasadh, atá ag teacht le teacht ar phríomh-mhóilíní virulence a bhfuil baint acu le baictéir agus víris.Mar sin féin, níl ár staidéar ach réamhscáileán agus tá móilíní eile ann a fhéadfaidh inflammasomes neamhchlasaiceacha a ghníomhachtú, mar a d'aimsigh ár staidéar roimhe seo inflammasomes clasaiceacha agus neamhchlasaiceacha araon in ionfhabhtú G. duodenalis [13].Chun a chinneadh tuilleadh an bhfuil baint ag an caspase-1 p20 a ghintear leis an NLRP3 inflammasome, d'aistrigh muid giardins alfa-2 agus alfa-7.3 isteach i macrophages peritoneal luch chun leibhéil léirithe próitéine móilíní eochair agus leibhéil oligomerization ASC a chinneadh, ag deimhniú go ngníomhaíonn an dá α-giardins. inflammasome NLRP3.Tá ár dtorthaí beagán difriúil ó thorthaí Manko-Prykhoda et al., a thuairiscigh gur féidir le spreagadh cealla Caco-2 le tréithchineálacha G. muris nó E. coli EPEC amháin méadú ar dhéine fhluaraiseachta NLRP3, ASC, agus caspase-1, cé nach bhfuil sé suntasach, cé gur mhéadaigh costas G. muris agus E. coli leibhéil trí phróitéin [49].D'fhéadfadh an neamhréiteach seo a bheith mar gheall ar dhifríochtaí i roghnú speiceas Giardia, línte cille, agus cealla príomhúla.Rinneamar measúnuithe in vivo freisin ag úsáid MCC950 ar lucha baineann 5 seachtaine d'aois WT C57BL/6, atá níos so-ghabhálaí do G. duodenalis.Is inhibitor NLRP3 móilín beag cumasach agus roghnach é MCC950 a bhlocálann gníomhachtú canónach agus neamh-chanónach NLRP3 ag tiúchan nanomolar.Cuireann MCC950 bac ar ghníomhachtú NLRP3 ach ní chuireann sé isteach ar ghníomhachtú cosáin athlastacha AIM2, NLRC4, agus NLRP1 nó cosáin comharthaíochta TLR [27].Cuireann MCC950 bac ar ghníomhachtú NLRP3 ach ní chuireann sé bac ar thionscnamh NLRP3, eisreabhadh K+, sní isteach Ca2+, ná ar an idirghníomhú idir NLRP3 agus ASC;ina ionad sin, cuireann sé bac ar ghníomhachtú inflammasome NLRP3 trí bhac oligomerization ASC [27].Mar sin, d'úsáideamar MCC950 i staidéar in vivo chun ról an NLRP3 inflammasome tar éis instealladh giardine a chinneadh.Cleaves caspase-1 p10 gníomhachtaithe cytokines pro-inflammatory pro-IL-1β agus pro-IL-18 isteach aibí IL-1β agus IL-18 [50].Sa staidéar seo, úsáideadh leibhéil serum IL-1β i lucha cóireáilte le giardine le MCC950 nó gan iad mar tháscaire ar an ngníomhaíodh an NLRP3 inflammasome.De réir mar a bhíothas ag súil leis, laghdaigh cóireáil MCC950 go suntasach leibhéil serum IL-1β.Léiríonn na sonraí seo go soiléir go bhfuil G. duodenalis giardin alfa-2 agus giardin alfa-7.3 in ann an luch inflammasome NLRP3 a ghníomhachtú.
Léirigh sonraí suntasacha carntha le deich mbliana anuas gurb é IL-17A an príomh-rialtóir díolúine i gcoinne G. muris, rud a spreagann comharthaíocht IL-17RA, peptides frithmhiocróbach a tháirgeadh, agus gníomhachtú comhlántach a rialáil [51].Mar sin féin, tarlaíonn ionfhabhtú Giardia níos minice i ndaoine fásta óga, agus tuairiscíodh nach ngníomhaíonn ionfhabhtú Giardia i lucha óga an freagra IL-17A chun a éifeacht cosanta a fheidhmiú [52], rud a spreagann taighdeoirí chun Giardia inmunomodulatory eile a chuardach.meicníochtaí ionfhabhtú helminth.Thuairiscigh údair staidéir le déanaí gur féidir le G. muris an NLRP3 inflammasome ag E. coli EPEC a ghníomhachtú, rud a chuireann táirgeadh peiptídí frithmhiocróbacha chun cinn agus a laghdaíonn a chumas ceangail agus líon na trophozoites sa chonair intestinal, rud a laghdódh déine an colon. galair de bharr bacilli [49 ].Tá baint ag an NLRP3 inflammasome le forbairt galair éagsúla.Tá sé léirithe ag staidéir go spreagann Pseudomonas aeruginosa autophagy i macrophages chun bás cille a sheachaint, agus braitheann an próiseas seo ar ghníomhachtú an NLRP3 inflammasome [53].Maidir le N. caninum, cuireann gníomhachtú ocsaigine-idirghabhála speiceas-idirghabhála an NLRP3 inflammasome teorainn lena mhacasamhlú san óstach, rud a fhágann go bhfuil sé ina sprioc teiripeach féideartha [9].Fuarthas amach go n-eascraíonn paracoccidioides brasiliensis gníomhachtú an inflammasome NLRP3 i gcealla dendritic díorthaithe smeara luiche, rud a fhágann gur scaoileadh an cytokine athlastach IL-1β, a bhfuil ról ríthábhachtach aige i gcosaint óstach [10].Gníomhaíonn roinnt speiceas Leishmania, lena n-áirítear L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, agus L. infantum chagasi, NLRP3 agus caspase-1 atá ag brath ar ASC i macrophages, chomh maith le ionfhabhtú Leishmania.Cuirtear feabhas ar mhacasamhlú parasite i lucha atá easnamhach sa ghéin NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Tá Zamboni et al.Tuairiscíodh go spreagann ionfhabhtú Leishmania gníomhachtú an NLRP3 inflammasome i macrophages, rud a chuireann srian ar mhacasamhlú seadán intracellular.Mar sin, féadfaidh Leishmania bac a chur ar ghníomhachtú NLRP3 mar straitéis seachanta.I staidéir in vivo, chuir an NLRP3 inflammasome le deireadh a chur le Leishmania, ach níor chuir sé isteach ar fhíocháin [54].Os a choinne sin, i staidéir helminthiasis, chuir gníomhachtú an inflammasome NLRP3 faoi chois díolúine cosanta an óstaigh i gcoinne helminthiasis gastrointestinal [12].Tá Shigella ar cheann de na príomh-baictéir is cúis le buinneach ar fud an domhain.Is féidir leis na baictéir seo táirgeadh IL-1β a spreagadh trí eisreabhadh K+ receptor-mediated P2X7, speicis ocsaigine imoibríocha, aigéadú líosómach, agus damáiste miteachondrial.Rialaíonn an NLRP3 inflammasome diúltach phagocytosis agus gníomhaíocht bactericidal macrophages i gcoinne Shigella [55].Léirigh staidéir Plasmodium go dtáirgeann lucha easnamhacha AIM2, NLRP3 nó caspase-1 atá ionfhabhtaithe le Plasmodium leibhéil arda de chineál 1 interferon agus go bhfuil siad níos resistant d'ionfhabhtú Plasmodium [56].Mar sin féin, níl an ról atá ag giardine alfa-2 agus alfa-7.3 giardine maidir le gníomhachtú pataigineach athlasadh NLRP3 i lucha soiléir.
Sa staidéar seo, laghdaigh cosc ​​​​ar an NLRP3 inflammasome le MCC950 BW agus mhéadaigh sé líon na trophozoites i sreabhán lavage intestinal i lucha, rud a d'eascair athruithe paiteolaíocha níos déine i bhfíochán duodenal.Gníomhaíonn alfa-2 giardine agus alfa-7.3 giardine an luch óstach NLRP3 inflammasome, méadú ar mheáchan coirp na luiche, laghdaigh líon na trophozoites i sreabhán lavage intestinal, agus laghdaítear loit duodenal paiteolaíocha.Tugann na torthaí seo le fios gur féidir le G. duodenalis inflammasome óstach NLRP3 a ghníomhachtú trí giardine alfa-2 agus giardine alfa-7,3, ag laghdú pataigineacht G. duodenalis i lucha.
I dteannta a chéile, léiríonn ár dtorthaí go spreagann giairdíní alfa-2 agus alfa-7.3 gníomhachtú an óstaigh NLRP3 inflammasome agus go laghdaítear ionfhabhtaíocht G. duodenalis i lucha.Dá bhrí sin, is spriocanna geallta iad na móilíní seo chun giardiasis a chosc.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: forbhreathnú.Tugadh le fios le déanaí go bhfuil ailléirgeach ag Pat Inflamm le drugaí.2019; 13:134-43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: athbhreithniú ar chógasteiripe.Tuairim Saineolaithe ó chógaiseoir.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, frithsheasmhacht in aghaidh drugaí agus teacht ar spriocanna nua.Infects Spriocanna drugaí Neamhord.2010; 10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, etc NLRP3 galair athlastacha agus athlastacha.Ocsaíd Med Cell Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Ról an inflammasome in athlasadh stéigeach agus ailse.Gaistreintreolaíocht.2011;141: 1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical agus aitíopúla NLRP3 gníomhachtú inflammasome ag crosbhóthar caoinfhulaingt imdhíonachta agus athlasadh gut.réamh-imdhíonachta.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Tá gníomhachtú inflammasome NLRP3 ROS-idirghabhála i gceist mar fhreagra ar ionfhabhtú N. caninum.Paraisítí veicteoir.2020; 13:449.